近日，中国农业科学院作物科学研究所/国家南繁研究院作物精准育种技术创新团队联合华中农业大学水稻团队在Plant Biotechnology Journal上发表了题为Transgene-Killer-CRISPR version 2 (TKC2) eliminates occasional transgene escape by coupling with a RUBY reporter的研究论文，成功开发了新一代基因编辑技术——Transgene-Killer-CRISPR version 2（TKC2），实现了无转基因基因编辑“降本增效”。

      Transgene-Killer-CRISPR（TKC）技术是一种能够在一代内分离出不含转基因的编辑植株的技术，但存在转基因偶尔逃逸的问题。为解决这一难题，研究人员将可视化RUBY报告基因（https://zhaolab.biosci.ucsd.edu/ruby/）与TKC技术相结合，开发了TKC2系统。该系统通过将RUBY与CRISPR偶联，形成inTGR-Cas9-RUBY单一基因盒，以RUBY颜色作为gRNA和Cas9表达水平的可视化指标。实验发现，RUBY在愈伤组织、根、叶和茎中均有不同程度的积累，且RUBY颜色可有效指示转基因阳性及基因编辑效果。研究人员进一步将RUBY与四种TKC自杀盒相结合，生成RUBY-TKC（TKC2）系列载体。以SE5基因和YSA基因为靶点进行实验，结果表明，所有呈现RUBY颜色的T0代植株均为转基因植株，且RUBY植株的靶基因位点编辑效率高于绿色植株，RUBY颜色与靶基因编辑之间存在很强的相关性，可作为判定转基因突变植株的合适指标。在T1代目标基因编辑水稻植株中，TKC2策略显著提高了转基因的消除能力。不同TKCs组合的T1代中，至少96.00%的植株不携带转基因，其中TKC2.1实现了100%的转基因清除。全基因组测序分析进一步证实，TKC2已成功从水稻基因组中清除了转基因成分。此外，该技术还可防止转基因花粉或种子释放到环境中，有效缓解了人们对转基因元件广泛传播的担忧。

TKC2技术的成功开发，不仅解决了传统TKC技术中转基因偶尔逃逸的问题，还无需在T0代及后续代进行基于PCR的转基因分型，大大提高了获得无转基因基因组编辑水稻植株的效率。该技术具有广泛的适用性，可应用于其他CRISPR/Cas系统和有性繁殖作物，有望在植物遗传研究和作物遗传改良中得到广泛应用，为推动农业科技进步和保障粮食安全提供有力支撑。

具体过程如下：

首先，研究人员通过将RUBY与CRISPR偶联，成功开发了RUBY-CRISPR（图1）。将inTGR（tRNA-gRNA-Ribozyme）与含有Cas9和RUBY编码序列的外显子融合，形成一个合成基因（inTGR-Cas9-RUBY）（图1a）。选择与CaMV 35S增强子融合的黄叶卷曲病毒启动子（CmYLCV）来表达该合成基因，以便使用可见标记RUBY作为gRNA和Cas9表达水平的指标。研究发现，RUBY在愈伤组织、根、叶和茎中都有不同程度的积累（图1b）。RUBY颜色是无转基因效率的良好指标（图1c）。

    随后，作者将RUBY与TKCs相结合，以富集T0代目标基因编辑的水稻植株。作者设计了三种类型的自杀盒（小配子特异型、胚乳特异型和合子特异型），并将自杀盒放置在RUBY-CRISPR单元附近，生成RUBY-TKC（TKC2）系列质粒。每个RUBY-TKC质粒包含两种自杀转基因盒（图2a）。RUBY-TKC1（TKC2.1）包括pREG2:: BARNASE和p35S:: CMS2。RUBY-TKC2（TKC2.2）包括pZmPG47:: ZmAA1与pREG2:: BARNASE。RUBY-TKC3（TKC2.3）包括pZmPG47:: ZmAA1和pLTP2:: BARNASE。RUBY-TKC4（TKC2.4）包括pZmPG47:: ZmAA1与pNF-YB1:: BARNASE。以SE5基因和YSA基因为靶点，来测试TKC2策略的有效性和适用性（图2b）。作者发现所有呈现RUBY颜色的T0代植株均为转基因植株，且大多数RUBY植株在靶基因位点的编辑效率高于绿色植株（图2c），表明RUBY颜色可以作为编辑效率的良好指标。RUBY表达与靶基因编辑之间存在很强的相关性，这表明RUBY可以作为在T0代中判定转基因突变植株的合适指标，并且不会对植物遗传改良产生负面影响。

图2. 将RUBY-CRISPR与TKCs结合，在T0代中获得定向诱变转基因植株

      将RUBY与TKCs相结合，可以有效去除T1代目标基因编辑水稻植株中的转基因。作者首先统计了不考虑RUBY颜色时T1代中无转基因幼苗的比例（图3a）。结果显示，不同TKCs组合之间的转基因消除能力存在差异，且均存在不同程度的转基因泄露。当考虑RUBY颜色时，作者发现RUBY是TKCs中转基因逃逸的有效可视化方法，TKCs与RUBY的组合提高了T1子代中的转基因消除能力。在TKC2四个组合的T1植物中，至少96.00%的T1植株不携带转基因，其中TKC2.1实现了100%转基因清除。表明TKC2策略在消除转基因方面非常有效。随后作者分析了突变T0植株的绿色子代中的靶基因编辑情况，发现大多数编辑突变在后续世代中稳定遗传，同时也存在一些嵌合的分离模式，表明Cas9的存在不利于突变的稳定遗传（图3d）。

图3. 使用TKC2测试转基因消除和基因编辑的效率

   为了进一步验证上述结果，作者选择了四个TKC2组合的T1代中的部分突变体进行了全基因组测序（图4）。分析发现，24个无转基因绿色突变体的基因组分析未发现T-DNA构建体的片段，表明TKC2已成功从水稻基因组中清除了转基因成分。

图4. 使用全基因组测序数据对TKC2子代中的转基因进行基因组定位

图5. 通过pCXUN-Cas9、TKC、RUBY-CRISPR和TKC2s系统分离无转基因水稻植株的流程图

华中农大已毕业博士生朱敏为论文第一作者，作科所和玉兵副教授为论文通讯作者。中国农科院团队首席夏兰琴研究员、加州大学圣地亚哥分校赵云德教授和华中农业大学作物遗传改良全国重点实验室熊立仲教授为该研究做出了重要指导。该研究得到国家自然科学基金、中国农科院青年专项、南繁专项、海南崖洲湾种业实验室揭榜挂帅项目等资助。